|
|
|
| 您的位置是>> 首页 >> 抗原抗体反应总论>>
沉淀反应>> 免疫电泳技术 |
| |
免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。由Graber和Willians1953年首创将凝胶扩散置于直流电场中进行。该技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度，二是将某些蛋白组分跟据其带电荷的不同而将其分开，再与抗体起反应，从而使本法更为微量化，多样化，使其应用范围日益扩大。常用技术有以下几种。
1．免疫电泳（immunoelectrophoresis，IEP）
1）原理 先用区带电泳技术将蛋白质抗原按其所带电荷，分子量和构型不同，在凝胶中电泳分成不同区带，然后与电泳方向平行，挖一条型槽，加入相应抗血清，置室温或37℃，使抗原和抗体呈双相扩散而在相应位置上形成肉眼可见的弧形沉淀线，根据沉淀弧的数量，位置和形态，可分析样品中所含抗原成分及性质。
2）技术要点
①取洁净载玻片，浇注融化的琼脂凝胶，凝固后打孔挖糟。
②用微量加样器加待检标本或正常血清对照于孔内。
③电泳条件以电压4～6V／cm或电流2～3mA／cm为宜，电泳1.5~2h。
④电泳完毕后，用毛细滴管在槽内加入含相应抗原的混合抗原，孵育，使抗原抗体双相扩散，形成沉淀线。
⑤观察沉淀线的数目、形状和位置。经漂洗、干燥、染色、脱色等步骤制作染色标本，可长期保存。
2．火箭免疫电泳 火箭免疫电泳（rocket immuno electrophoresis, RIE）技术是把抗原置于含有抗体的凝胶内电泳，实际上是一种通过电泳进行加速的单相免疫扩散技术，1966年Lawrell建立，由于其沉淀形似火箭，故称为火箭电泳。
１）原理 当抗原与凝胶中抗体，在电场作用下移动，逐渐形成梯度浓度，在抗原抗体比例适当时形成不溶性免疫复合物沉淀 线而沉淀，随着抗原量的减少，沉淀带越来越窄，形成火箭峰样沉淀带，峰形高低与抗原量成正比。
２）技术要点
①制备抗体琼脂糖凝胶板 将已融化的1.2％巴比妥缓冲琼脂糖冷却至55℃左右，加入适量抗血清，混匀后立即浇板，置室温凝固。
②打孔 在琼脂凝胶板一侧打孔，孔径3mm，孔距2mm。置琼脂板于电泳槽内，搭桥后用微量注射器准确加样10μl。
③电泳 样品孔放负极侧，电压8～10V／cm或电流3～5mA／cm，电泳6h。
④观察沉淀峰 电泳完毕后，观察琼脂板上沉淀峰，并测量从孔中心到峰尖的高度。
⑤绘制标准曲线图 以峰高为纵坐标，浓度为横坐标(对数坐标)，绘制标准曲线，求出待检样品内抗原浓度。
3．对流免疫电泳
１）原理 对流免疫电泳（counter immuno electrophoresis, CIEP）实质上是定向加速的电泳技术与免疫双相扩散技术的结合。在PH8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白因等电点高，带微弱的负电荷，且分子量较大，因此电泳力小，小于电渗力，泳向负极；而一般抗原蛋白常带较强的负电荷，且分子较小，电泳力大，泳向正极电泳时，抗原放负极侧孔，抗体放正极侧孔，抗原抗体相对泳动，在两孔间相遇，比例合适时形成肉眼可见的沉淀线。若抗原浓度超过抗体，沉淀线靠近抗体孔。
２）技术要点 ①制备1．2％巴比妥琼脂凝胶板。②在琼脂板上成对打孔，孔径3mm，孔距6mm。③于阴极侧孔内加入待检血清或阳性对照血清，阳极侧孔内加抗血清。④电泳
电泳条件3—4mA／cm宽，电泳30min。⑤观察结果或在室温放置数小时后观察沉淀线。
|
|
|
|
| |
