1．半抗原与载体连接时，应选择合适的方法，结合方式的选择应考虑如下因素：

　　1）半抗原的溶解度和稳定性：在结合反应中应不导致半抗原活性的改变，同时也不能使载体变性至不溶解的程度。

　　2）结合键的位置：抗体对远离蛋白质联接点的半抗原部分有最好的特异性，故联接时应使联接键远离半抗原的决定簇。

　　3）选择适合的偶联试剂：不同的半抗原在偶联时，应根据半抗原的化学结构，以及反应方式选择适当的偶联试剂。如小分子肽类有一定的三级结构，在溶液中依靠氨基酸残基来维持其结构的稳定。因此，用双功能的亚氨酸酯不但对氨基酸有选择，而且能代替被取代的每一个ε-氨基的正电荷。蛋白质与偶联剂接触后，使不同蛋白质分子的功能基团交联并凝聚。广泛交联的蛋白质，其溶解度常降低，而这种溶解度差的蛋白质却是有效的免疫源。

　　常用的偶联剂见表1。

　　2．连接方法 半抗原与载体的连接通常可用物理和化学方法进行。物理吸附的载体有羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，它们借电荷和微孔吸附半抗原。化学法则是利用某些功能基团把半抗原连接到载体上，这些载体包括血清白蛋白、甲状腺球蛋白、铜蓝蛋白、卵蛋白和人工合成的多聚赖氨酸。带有游离氨基或游离羧基以及两种基团都有的半抗原，可直接与载体连接。其他不带有氨基或羧基的半抗原，须加以适当的改造，使其转变为带有游离氨基或游离羧基的衍生物，才能与载体连接。

　　1） 有游离氨基或游离羧基以及两种基团都有的半抗原与载体的连接方法

　　（1）碳化二亚胺法：碳化二亚胺是一种化学性质非常活跃的双功能试剂，它们既可与半抗原上的羧基又可与半抗原上的氨基缩合。 此法非常简便，只要将半抗原与载体蛋白质按一定分子比混合在适当的溶液中，然后加入碳二亚胺，搅拌l～2h，置室温反应24h，最后透析除去未反应的半抗原，即可得到人工免疫原。

　　（2）戊二醛法：戍二醛是带有两个活性基团双功能的连结剂，它借助两端的醛基与载体和半抗原的氨基以共价键连接，其反应如下：

　　（3）混和酸酐法：混合酸酐法又称为氯甲基异丁酯法，主要用以甾体激素与蛋白质的偶连。以烷基氯甲基为偶连剂，最常用的是氯甲基异丁酯。含有羧基的半抗原与氯甲基异丁酯反应形成混合酸酐，然后在与蛋白质载体上的氨基反应形成肽键。其反应如下：

　　（4）过碘酸氧化法：过碘酸将糖环氧化成双醛基，再与蛋白质上的氨基偶联。本法常用于配糖体类药物与蛋白质的偶联。

　　 2） 带有氨基或羧基的半抗原可用下面方法改造后，再用上述方法进行连接

　　（1） 琥珀酸酐法：本法用于带有羟基的半抗原的改造。琥珀酸酐加水转变成琥珀酸。如将带有羟基的半抗原和琥珀酸酐在无水吡啶中反应，即可得到带有羧基的半抗原琥珀酸的衍生物。其反应式如下：

　　（2） 羧甲基羟胺法：带有酮基的半抗原（如孕酮、睾酮）与O-(羧甲基)羟胺反应，转变为带有羧基的半抗原衍生物。其反应式如下：

　　（3） 重氮化的对氨基苯甲酸法：本法适于带有酚基的半抗原（如某些药物）的改造。先将对氨基苯甲酸和亚硝酸钠反应，反应产物再作用于带有酚基的半抗原，从而制得带有羧基的半抗原衍生物。 　　（4）一氯醋酸钠：本法适于带有酚基半抗原的改造。将带有酚基的药物与一氯醋酸钠反应即可得到带有羧基的半抗原衍生物。