1． 抗体的特异性：为获得特异性强的抗体，并不是半抗原分子上任何功能基团都可以用来与蛋白质联接，也不是毫无选择的在半抗原分子上添加可以与载体联接的功能基团。根据目前的认识，抗体的特异性主要是针对距蛋白质联接点最远端的半抗原部分。因此，应将对免疫识别来说最不重要的半抗原部分联接到蛋白质上。这就是所谓的联接半抗原的"远距离"原则。如雌二醇的特殊功能基团有两个，即C3-OH和C17-OH。如在C6位与蛋白质联接，形成E2-6-(O-羧甲基)肟，则所得到的抗血清的特异性就好；如在C17位与蛋白质联接，形成E2-17-半琥珀酸酯，则所得到的抗血清的特异性就差。前者与雌素酮和雌三醇的交叉广反应率分别为8.0%和0.3%，而后者分别为100%和10%。在实际联接时可用特殊试剂将特异的功能基团封闭，然后进行偶联，最后再将封闭剂去掉。

　　2．半抗原的取代水平：半抗原联接到载体蛋白上的分子数可影响动物产生抗体的能力。结合半抗原的多少，依半抗原的性质和动物的品种而异。文献报告每个载体分子只含一个半抗原分子就足以产生半抗原的抗体。一般认为，如以白蛋白为载体，每个白蛋白分子上联接5～30个半抗原分子较好。从有利于激发对半抗原亲和力强的抗体产生细胞，联接到蛋白质上的半抗原数少一些可能更好。但也有人认为，在免疫后期某些细胞逐渐对半抗原显示足够高的亲和力，以致能用半抗原-异源载体(即与初始免疫时所用的载体不同)结合物进行触发，此时免疫应答的大小可能部分的与半抗原的取代数目有关。 半抗原的取代水平可用放射性示踪法或分光光度法进行测定。

　　【放射性示踪法】在偶联的反应液中加入一定量的放射性标记半抗原。偶联反应后经充分透析，测量透析袋中的放射性计数，并计算结合到载体上的放射性百分数。这个百分数指示有同样百分比的非标记半抗原联接到载体上。结合抗原中半抗原与蛋白质的分子比可用下列公式计算：

　　　[Pm1 / MW1 ] / [m2 / MW2 ]

　　　其中：P = 放射性百分数；m1 = 半抗原投入量；MW1 = 半抗原的分子量； m2 = 蛋白质的投入量； MW2 = 蛋白质的分子量。

　　【分光光度法】 根据半抗原的克分子消光系数估算：配制相同浓度的偶联物和纯蛋白溶液，分别在同一波长下读取OD值，然后按下列步骤计算：

　　半抗原OD值 = 偶联物OD值－纯蛋白OD值

　　半抗原克分子浓度 = 半抗原OD值 / 克分子消光系数

　　蛋白质浓度 = 偶联物浓度－半抗原浓度

　　蛋白质克分子浓度 = 蛋白质浓度 / 蛋白质的分子量

　　[半抗原分子 / 蛋白质分子]比值 = 半抗原克分子浓度 /蛋白质克分子浓度

　　应用本法计算时应注意两点：

　　(1)读取OD值可选用任何波长，但偶联物与纯蛋白的OD值应有尽可能大的差异。即纯蛋白的读数要尽可能的低，以减少误差。同时该波长处，半抗原的克分子消光系数应为已知，否则须先用半抗原的纯品通过实验求出。

　　(2)由于联接上了若干分子半抗原，所以偶联物的分子量实际大于纯蛋白质的分子量，故计算的第一步有一定的误差。但蛋白质的分子量远大于半抗原，所以如果波长选择适当，使蛋白质的OD值尽量的小，则这种误差不会很大。半抗原与载体结合的数目与免疫原性密切相关。一般认为至少要有20个以上的半抗原分子连接到一个载体分子上，才能有效地刺激免疫动物产生抗体。因此，在半抗原与载体连接后，应测定偶联到载体上的半抗原量。常用吸收光谱分析法测定，如果半抗原基团有适宜的吸收光谱，测定在一定波长下复合抗原和载体之间克分子吸广度的差别，然后把这个差别与同样波长下半抗原的克分子吸光度数相比较，就可以准确地计数所结合的半抗原分子数。亦可应用同位素标记半抗原渗入法，在偶连反应液中加入一定量的放射性标记的半抗原。偶连反应后经充分透析，测量透析袋中的放射性计数，计算结合到载体上的半抗原分子数。