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免疫血清的制备与鉴定>> 抗体的纯化 |
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免疫血清除含有特异性抗体外，还存在其他的血清成分或非特异性抗体。这些成分必然会对实验结果产生影响。因此，抗血清在应用前首先要进行纯化，并且应对免疫血清的纯度、特异性、工作浓度、亲和力等多项指标进行鉴定。
1．抗体特异性的纯化
在制备抗血清的过程中往往由于免疫原不纯，含有性质相近的杂质，加之自然免疫原的影响，常有其他杂质抗体产生。在实验中为了提高抗血清的特异性，必须除去无关的抗体。具体方法有亲和层析法和吸附法两种。
1） 亲和层析法 亲和层析法是将交叉反应的抗原交联到Sepharose4B上，装柱后，将欲吸附抗体通过亲和层析柱，杂抗体吸附在柱上，洗脱液则是特异性抗体。
2） 吸附法 吸附法是将不含特异性抗原的抗原液，即不含用于免疫动物抗原的其他杂抗原液（如血清、组织液或已知的某种杂抗原），采用双功能试剂（如戊二醛）制备成固相吸附剂，将这种吸附剂直接加到免疫血清中（约1：10），杂抗体将和相应抗原结合。有时因杂抗体较多，必须处理两次才能完全除去。在制备固相吸附剂时，由于杂抗原较多，其他蛋白质也少，加入戊二醛后不形成胶冻状。此时可加入无关蛋白（如牛血清蛋白,兔血清蛋白等,加入量以达到含蛋白量的2%～3%为宜）进行交联即可达到目的。
2．IgG类抗体的纯化
在标记免疫测定和其他技术中，均采用IgG类抗体。因此，抗血清经特异纯化后，还必须提纯IgG。具体纯化方法如下。
1）粗提丙种球蛋白 一般采用硫酸铵盐析法，第一次用50%饱和度先去除白蛋白，第二次和第三次用33%饱和度沉淀丙种球蛋白。将沉淀复溶后进行透析除盐，便可获得部分纯化的丙种球蛋白。
2）离子交换层析提取IgG 常用的离子交换剂有DEAE纤维素或QAE纤维素。以QAE-sephadex最为常用。QAE-sephadex经处理平衡后，能吸附血清中的多种蛋白质，但不能吸附IgG。让欲纯化的抗血清经过层析后，即可获得较纯的IgG。
3）亲和层析法 采用亲和层析提取IgG时，可采用葡萄球菌蛋白A（SPA）致敏Sepharose4B并制备成亲和层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的IgG可与SPA发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH，IgG与固相基质上的SPA解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的IgG。
4．酶解法制备F（ab’）2片断和Fab片段。
利用酶对免疫球蛋白水解的专一性，分别采用胃蛋白酶或木瓜水解酶可将免疫球蛋白裂解，获得F（ab’）2片段或Fab片段。裂解后通过凝胶过滤可纯化F（ab’）2片段或Fab片段。
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