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免疫血清的制备与鉴定>> 抗体的鉴定 |
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1．抗体效价的鉴定
根据抗原性质的不同，抗体效价的测定方法不同。一般可溶性抗原可采用双向琼脂扩散的方法，颗粒性抗原可采用凝集实验的方法。
在标记免疫分析中，所用的抗体最终稀释度称为抗体的工作浓度，抗体在应用前应进行效价测定。在放射免疫分析中，抗体的滴度(titer)有其特定的定义，是指结合50%标记抗原时抗血清的稀释度。
抗体的滴度以在反应液中的稀释度表示。在实际工作中抗体的量可明显的影响试验的灵敏度和准确性。抗体过多可使试验的灵敏度下降，而抗体过少时试验的灵敏度虽高但重复性和准确度较差。为选择适当的抗体稀释度，可用连续稀释法确定(图4
-1)。将抗血清用加倍稀释法配成不同稀释度的溶液，然后分别加一定量的标记抗原，共同温育后分离结合的标记抗原抗体复合物和未结合的标记抗原。当B
/ F = 1，即B / T = 50%时的抗体稀释度即为最佳的稀释度。如只测量结合部分(B)，而且以B / B0 为纵坐标，以剂量为横坐标作剂量反应曲线，则B
/ T = 30%～50%时抗体的稀释倍数即为最佳的抗体稀释度。抗体(抗血清)的最佳稀释度(即抗体的滴度)越高，表明抗体的质量越好。
2． 体特异性鉴定
抗体的特异性鉴定一般采用相似的抗原与待鉴定抗体反应。如果出现交叉反应，说明有交叉抗体的存在。此时，可用相应抗原吸收，以提高抗体的特异性。
1）抗体特异性的表示方法及其计算：抗体的特异性以交叉反应率表示，其计算方法如下：交叉反应率 = [待测抗原50%结合时的浓度]
/ [待鉴定类似物50%结合时的浓度]·100%
应该注意的是，交叉反应曲线的横坐标应以物质的分子浓度(mol / L)表示。因为抗原-抗体反应应服从于质量作用定律，它们的结合不论是单价的还是多价的，都只能与分子数有关，即都以分子数为基础。因此，反应物和产物都应以分子浓度表示。Miller和Vaides比较了用分子浓度与质量浓度时的几种地高辛代谢产物的交叉反应率，结果发现二者有较大的差别，从而证明应以物质的分子浓度表示交叉反应率的重要性。
2）提高抗体特异性的方法：抗体的特异性是标志抗体优劣的重要指标。为提高抗体的特异性可用下列方法制备抗体。
用抗原的某些特异性分子片段免疫动物，这样得到的抗体较用全分子免疫动物得到的抗体特异性强。如用hCG的β亚单位免疫动物可得到对hCG高特异性的抗体。但用这种方法由于使用的抗原分子较小，所以抗体的产生比较困难。
用亲和层析方法进一步纯化。这种方法费时费力，而且收获率也较低，所以因成本高而比较少用。
用单克隆抗体代替抗血清，但单克隆抗体的反应强度不如抗血清，而且单克隆抗体所识别的抗原浓度与多克隆抗体(抗血清)所识别的抗原浓度也不完全相同。Yalow指出，由于在标记免疫分析中所使用的是充分稀释的抗血清，所以仅一小部分具有最高反应能力的抗体与抗原结合。因此，非均一抗体有可能提供比单克隆抗体更高的灵敏度。而单克隆抗体可提供更高的特异性。因而在选择应用的抗体时，应根据对实验系统的要求而定。如要求实验系统有高度的特异性，单克隆抗体较多克隆抗体好；如对特异性的要求不很高，而要求有较高的反应强度和灵敏度，则多克隆抗体有其一定的优越性。
3） 抗体纯度鉴定
抗体的纯度鉴定可采用区带电泳的方法。若只出现一条蛋白区带说明抗体纯化已达到要求。
4） 抗体亲和力鉴定
抗体的亲和力（affinity）是指抗原与抗体结合的牢固程度。亲和力越大表示抗体的结合反应越快，抗原抗体复合物越不易解离。亲和力的大小是由分子的大小、抗体结合的位点、以及抗原决定簇之间的立体构型的适合程度决定的。亲和力决定实验方法的灵敏度。因此，亲和力是评价抗体质量的重要指标。
抗体亲和力的大小以亲和常数表示，亲和常数就是表示抗血清中抗体分子的浓度。可用饱和曲线法进行计算。
饱和曲线法 饱和曲线法是用米氏公式计算亲和常数。以结合部分(B)为纵坐标，抗原浓度(M / L)为横坐标作图，为一条饱和曲线。取定量的一定稀释度的抗体，分别加入逐渐增加的抗原里，可使抗体的结合达到饱和，求出抗体饱和程度为50%时的游离抗原浓度，其倒数即为该抗体在此稀释度下的亲和常数。分别列出测定物的浓度、结合率、标记物和标准品的化学总量、标准物的总浓度(M
/ L)以及它的结合浓度(B, M / L)，然后作图求出F(50%饱和)的浓度，其倒数即为亲和常数(K)。
K = [AgAb] / [Ag][Ab]， [AgAb] = B [Ab] = F
当B / F = 1时，则 K = 1 / [Ag] = 1 / F (50%饱和)
亲和常数K的单位及其意义：亲和常数K的单位是L / M，其意义是1克分子抗体需要稀释多少升能够达到50%的结合率。亲和常数越大，稀释的倍数越高，所用的抗体量越小。
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