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单克隆抗体制备技术>> 杂交瘤技术的基本原理 |
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杂交瘤技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤，这种杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，即成为能够分泌抗体并能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞经过克隆化后成为单个细胞克隆，分泌的抗体即为单克隆抗体。
1．亲本细胞的选择与融合
1）免疫脾细胞 免疫脾细胞是经过抗原诱导活化的免疫细胞，主要是B淋巴细胞，它具有分泌抗体的能力。
2）骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞为B细胞系恶性肿瘤，具有在体外长期增殖的特性并且和B淋巴细胞融合率较高。用于杂交瘤技术的骨髓瘤细胞应具备如下要求：①选择有次黄嘌呤-鸟嘌呤核苷酸转换酶（HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（TK）缺陷的细胞株，此种骨髓瘤细胞不能在选择培养基中生长；②细胞能与B细胞杂交形成稳定的杂交瘤细胞，并分泌免疫球蛋白；③骨髓瘤细胞本身不分泌免疫球蛋白。目前常用的骨髓瘤细胞主要有：NS1细胞株，SP2/0细胞株。
3）细胞融合 融合(fusion)的方法很多，融合剂也有多种，如仙台病毒、溶血卵磷脂、和PEG等。近年有人用高强度电场短脉冲融合法，认为可以增加杂交率。目前仍以小分子PEG
(分子量为1000的PEG)最常用，其浓度在30%～50%之间。应该注意的是，不同批号PEG的毒性可有很大的区别，所以用前应慎重选择。
2． 选择性培养基的作用原理
将致敏B淋巴细胞与有代谢缺陷的骨髓瘤细胞进行细胞融合，这种融合是随机的，除骨髓瘤细胞和脾细胞融合外，还有骨髓瘤细胞之间和脾细胞之间的融合，以及一些未融合的细胞。其中骨髓瘤细胞与脾细胞融合后，形成杂交瘤细胞。这些细胞中，只有杂交瘤细胞能够在特殊HAT培养基中存活，从而将杂交瘤细胞分离出来。
1）HAT培养基 HAT培养基是一种选择培养基，其中含有次黄嘌呤（H）、氨基蝶吟（A）、胸腺嘧啶（T），它是根据细胞内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成途径设计的用于筛选杂交瘤细胞的特殊培养液。
2）选择性培养基的作用原理：细胞的DNA生物合成有两条途径，一条是生物合成的主要途径，即由氨基酸及其小分子化合物合成核苷酸，进而合成DNA。在这一合成途径中，叶酸作为重要的辅酶。另一途径为辅助途径，以次黄嘌呤和胸腺嘧啶为原料，在次黄嘌呤-鸟嘌呤核苷酸转换酶（HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（TK）的催化作用下合成DNA。HAT培养基中含有氨基蝶呤（为叶酸拮抗剂），故所有细胞的DNA主要合成途径均被阻断，只能通过辅助进行DNA的合成。
HGPRT缺陷型或TK缺陷型的骨髓瘤细胞在HAT培养基中因不能通过旁路合成DNA而死亡。脾细跑虽有HGPRT或TK，但不能在体外长期培养繁殖，一般在2周内死亡。而杂交瘤细胞因从脾细胞获得HGPRT或TK，可通过旁路合成DNA，同时又具备肿瘤细胞的特点，在体外培养中可以长期繁殖生长。选择性培养基的作用原理如表1。
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