（一）荧光的产生 某些物质能够从外部接受能量而进入激发态，当其从激发态回复至基态时，过剩的能量以电磁波的形式发射称为发光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，荧光现象随即停止。可引发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为光致荧光，由化学反应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用光致荧光物质进行标记。

　　（二）荧光效率 荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，而是或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光的光量子数值成正比，其关系如下式：

　　　　　　荧光效率=

发射荧光的光量子数亦称荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。选择激发光波长最接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波最接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。

　　（三）荧光的淬灭 荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至淬灭。这与激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量不能以荧光形式发射有关。一些化合物如苯胺、酚、硝基苯及一些卤化物等都有较强的荧光淬灭作用，在进行荧光免疫试验中，要避免沾染这些物质。另外，这些物质可被用作淬灭剂来消除不需要的荧光。例如，用硝基苯处理有荧光的镜油。荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。在荧光抗体染色技术中常用一些非荧光的色素复染标本，可减弱非特异性荧光本底，使特异荧光更突出显示。常用的复染剂有亚甲蓝、碱性复红、伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等。

　　（四）荧光素 荧光素是具有光致荧光特性的染料，荧光染料种类很多，目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种。

　　1．异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。

　　2．四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。 　　3．四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC) TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。

　　4．酶作用后产生荧光的物质 某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如，4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性磷酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。 5．镧系螯合物 某些3价稀土镧系元素如铕 (Eu3+)、铽 (Tb3+) 等的螯合物可发射特征性的荧光，而且激发光波长范围宽、发射光波长范围窄、荧光衰变时间长，最适合于时间分辨荧光免疫测定。