1．pH 荧光素在溶剂中基本上处于离子化状态，因此，溶剂中的氢离子浓度对荧光强度的影响是极大的。每一种荧光素都有自己合适的pH值，它保持荧光素分子与溶剂之间的电离平衡。pH的改变可以引起荧光素荧光光谱的改变，并可造成荧光强度的降低。

　　2．温度 一般情况下，环境温度的升高对荧光染色有明显的影响。因为，温度升高可造成溶液粘滞性增加，溶剂和荧光素分子的动力增大，使荧光淬灭的可能性随之加大，这就使荧光素分子与其他分子之间的相互碰撞几率增加，因此，影响了荧光素的荧光强度。一般情况下，温度在20℃时，荧光素即开始表现温度淬灭作用。随温度升高，荧光淬灭作用就越强，可至荧光完全淬灭。温度在20℃以下，荧光素的荧光强度随温度的变化改变不明显，基本上保持恒量。因此，在适当的低温环境中进行荧光显微观察，可得到更好的效果。

　　3．荧光素的浓度 在溶液浓度较稀时，荧光强度随荧光素浓度增加而增加。当荧光素浓度增加到一定程度时，荧光强度达到最大。再继续增加浓度，荧光素发生的光可能被邻近的分子吸收，使荧光强度下降。

　　4．某些细胞固定剂对荧光素有明显影响，如甲醛固定的细胞比不固定的细胞荧光强度减弱50%左右。虽然醇类固定剂也有轻微的淬灭荧光作用，但其影响较小。

　　5．非特异性荧光染色 免疫荧光染色除特异性荧光之外，还出现一些与靶抗原-抗体反应无关的荧光，统称为非特异性荧光。非特异性荧光染色可由于某些抗原的自发荧光及交叉反应等多种因素产生。有些非特异性荧光染色可通过对照进行鉴别与排除，有些则要通过对抗原的纯化、抗体的提纯、提高荧光抗体结合物的比例等方面寻找原因逐项清除。