（一）基本原理 时间分辨荧光免疫测定 (time-resolved fluorescence immunoassay, TR-FIA)是以镧系元素螯合剂标记抗原或抗体，利用荧光发射体荧光寿命差别而将波长相同的荧光分开的近代荧光光谱技术。

　　TR-FIA中使用的镧系元素有铕（Eu3+）、钐(Sm3+)、铽 (Tb3+)、铌(Nd)、镧(Dy)等，其中以Eu3+最为常用。镧系的三价阳离子不能直接与蛋白质结合，因此要用特殊的螯合剂将Eu3+等与蛋白质偶联，以获得稳定的Eu3+等标记的抗体或抗原结合物。常用的螯合剂有异硫氰酸-苯基-EDTA、1-（P-苯偶氮）-EDTA、二乙烯三胺五醋酸(DTPA)等。

　　由于镧系元素与抗原（或抗体）络合后，在激发光作用下，能量转移较差，发出的荧光很弱，因此，在测量时需加入荧光增强剂(β-，使复合物中稀土离子解离出来，再与增强液中β-二酮体生成新的螯合物，经紫外光激发可产生很强的荧光信号，荧光增强达上百万倍，大大有利于荧光测量。

　　（二）技术类型

　　1．固相双位点夹心法 标准品或待测物先与固相抗体反应，洗涤后再加入Eu3+标记抗体，再次温育，生成Eu3+标记抗体-抗原-固相抗体复合物，充分洗涤后加入增强液，测定荧光强度，所测得荧光强度与待测物的浓度呈正比。

　　2．固相抗原竞争法 将大分子抗原直接或半抗原通过化学偶联法制成半抗原-蛋白质结合物包被在固相上，成为固相抗原，固相抗原和样本中的待测抗原共同竞争有限量的Eu3+标记抗体，样本中待测抗原浓度越高，则Eu3+标记抗体结合到固相上的量越少，故待测抗原浓度和荧光强度呈反比。

　　3．固相抗体竞争法 待测标本中抗原和Eu3+标记的抗原与固相抗体(特异性抗体包被固体)发生竞争性结合, 温育和洗涤后,把游离Eu3+标记抗原和Eu3+标记抗原抗体复合物分开,然后在固相中加入荧光增强剂,测定Eu3+标记抗原抗体复合物的荧光强度。荧光强度与待测抗原含量成反比，标准曲线与RIA曲线相似。目前为了生产试剂盒的方便，常用抗抗体（Ab2）包被固相，这种固体的抗抗体实际上是一种通用的分离剂，分离Eu3+标记抗原和Eu3+标记抗原抗体复合物。

　　（三）技术要点

　　以双位点夹心法测AFP为例。以抗人AFP多克隆抗体包被聚苯乙烯微量滴定条或珠，加入不同浓度的AFP标准品和待测血清，加入缓冲液反应4～6h。洗涤后，加入生物素化抗人AFP单抗，振荡温育反应4～6h。洗涤后，加入Eu3+标记链亲和素，振荡反应1h。洗涤后，加入增强液，快速振荡15min，放置15min后在时间分辨荧光仪上测量，从编制程序直接得出待测血清中AFP浓度。

　　（四）方法学评价 与传统的荧光素比较，镧系元素螯合物的一个特点是具有较长的荧光寿命。如铕的荧光寿命为4.3×108ns（纳秒），而人血清蛋白的自然本底荧光约1～10ns，相差5个数量级。利用延缓荧光测量时间，待短寿命的自然本底荧完全衰退后测定，所得信号完全是长寿命镧系元素螯合物的荧光（图13-4），这样能有效地消除非特异性本底荧光的干扰。另一个特点是激发光与荧光发射光的波长差别显著，其波长转变达270nm，这又十分有利于排除非特异性荧光干扰，提高荧光信号的测量特异性，且发射光谱陡峭，荧光强度高，灵敏度高（可达0.2～1ng/ml）。

　　本法所用的检测仪器为时间分辨荧光仪。与一般的荧光分光光度仪不同，时间分辨荧光仪采用脉冲光源（每秒闪烁1000次以上的氙灯），照射样品后即短暂熄灭，以电子设备控制延缓时间，待非特异荧光本底衰退后，再测定样品发出的长寿命镧系荧光。

　　TR-FIA在灵敏度、特异性和稳定性等方面都可与放射免疫测定法（RIA）相媲美。而其线性范围宽 (跨越4～5个数量级)、分析速度快，却远远超过RIA、常规免疫荧光技术、酶免疫测定技术。此外，标记物制备较简单，有效期长，无放射性污染，应用范围广，并且测定自动化程度高，因而成为很有推广价值的超微量物质免疫分析技术。

　　（五）临床应用 TR-FIA目前已有仪器和相应配套试剂盒供应，主要用于测定蛋白质、酶、肽类激素、甲状腺激素、类固醇激素、药物、肿瘤标记物及病毒抗原等。