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酶标记物的制备>> 酶标记抗体(抗原)的方法 |
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标记抗体(抗原)是指通过化学反应，让酶与抗体(抗原)形成结合物也称为酶标记物(Conjugate)。酶标记抗体(抗原)的方法有多种，常因酶不同而采用不同的法。常采用的标记方法一般应符合：
①技术方法简单、产率高；
②不影响酶和抗原)的生物活性；
③酶标记物稳定，本身不发生聚合；
④较少形成酶与酶、抗体与抗体或抗原与抗原的聚合物。
1．过碘酸钠法：
该法仅用于HRP的标记。HRP是一种糖蛋白，过碘酸钠可将与酶活性无关的多糖羟基氧化为醛基。此醛基很活泼，再与抗体蛋白的游离氨基结合，形成HRP—CH2—NH—IgG。为防止酶蛋白氨基与醛基反应发生自身偶联，常在标记前知用二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白上的α和ε氨基。酶与抗体的结合反应后，再加人硼氢化钠(NaHB4)还原后，即生成稳定的酶标记物。此法酶标记物产率较高，为常用的酶标记抗体的方法。
2．戊二醛交联标记法：
此法是以双功能交联剂为桥，使酶与抗体(抗原)结合。最常用的交联剂是戊二醛。它具有两个活性醛基，可分别与酶分子和抗体(抗原)分子上的氨基结合。戊二醛法又根据试剂加入的方法分为一步法和二步法。
一步法 将抗体(抗原)、酶和戊二醛同时混合。此法操作简便，广泛用于；HRP、AP与抗体(抗原)的交联。但酶标记物的产率低，由于结合物立体构型障碍，酶和抗体容易失活；酶和抗体易发生自身交联，影响标记效果。
二步法 先将过量的戊二醛与酶反应，让酶分子上的氨基仅与戊二醛分子上的醛基结合，不发生酶与酶的结合，除去未与酶结合的多余戊二醛后，再加入抗体(抗原)，形成酶—戊二醛—抗体(抗原)结合物。其优点是酶标记物均一，无自身聚合，分子量小易穿透细胞膜，灵敏度与活性均较高，但其产率更低。
3．利用抗原抗体反应实现酶结合物的标记：
利用化学反应进行酶结合物的制备，将不同程度的影响酶和抗体的生物活性。如以酶作为抗原与其相应抗体形成的免疫复合物代替酶标记物，就可提高酶免疫方法的灵敏度，减少化学偶联反应对酶和抗体活性的影响。因酶和抗酶抗体不用任何化学交联剂处理就可特异性结合，其活性不受影响。因此HRP—抗HRP(PAP)、AP—抗AP(APAAP)已广泛用于酶免疫技术中。近来又有人将双特异性抗体或杂交抗体用于酶免疫技术中，使酶免疫方法更加简便、特异性与灵敏性大大提高。
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