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酶标记物的制备>> 酶标记物的纯化及鉴定 |
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1．酶标记物的纯化：
标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游离抗体(抗原)、酶聚合物以及抗体(抗原)聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体(抗原)起竞争作用而降低特异性反应的强度。常用的纯化方法有葡聚糖凝胶G－200／G—150过柱层析纯化和50％饱和硫酸铵沉淀提纯等。
2．酶标记物的鉴定：
每批制备的酶标记物都要进行质量的鉴定，质量鉴定包括：
1）酶活性测定；
2）抗体(抗原)的免疫活性测定；
3）标记率的测定 常用分光光度法分别测定酶标记物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，再按公式计算其标记率。
如戊二醛法制备的HRP标记IgG，其酶标记率的计算方法如下：
酶结合量(mg／ml)=OD403X0.4
IgG含量(mg／m1)= （OD280 －OD403 X 0.42）X 0.94X0.62
过碘酸钠标记法的IgG含量(mg／m1)＝(OD280－OD403 X 0.3)X0.62。
计算克分子比或摩尔比(E／P)
HRP／IgG＝HRP(mg／m1)／HRP分子量÷IgG(mg／m1)／IgG分子量
=HRP(mg／m1)／40 000÷IgG (mg／m1)／160 000
＝HRP(mg／m1)／IgG(mg／m1)X4
(E／P)一般为l一2。
酶的标记率二结合物中酶量／标记时的酶量X100％ (或酶的标记率= OD403／OD280)
一般酶量为lmg／ml、HRP／IgG在1.5—2.0之间、酶的标记率大于0.3。
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