| |
1．抗原或抗体的固相化技术
抗原抗体的固相化是指将抗原或抗体和固相载体连接的过程，这一过程也称包被（Coating），包被抗原或抗体是ELISA的前提，同时也ELISA的关键技术之一。
1） 固相载体 理想的固相载体应具备：良好的吸附性能；透明度高，本底低；吸附后不影响抗原或抗体的活性。常用材料有聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯酰胺、琼脂糖、硝酸纤维素膜等，以聚苯乙烯最为常用。
聚苯乙烯可制作成微孔反应板（96 well,48 well ,8 well,12 well）、小试管、小圆珠，其中以微孔板最为常用。微孔反应板的优点：可以同时进行大量标本的测定，利于操作的标准化。
2） 固相方法――被动吸附法 采用被动吸附法，常用的包被缓冲液有PH 9.6碳酸盐和PH 7.4磷酸盐。用包被缓冲液将欲包被的抗原或抗体稀释到一定浓度（不同的抗原或抗体包被的浓度有所不同，应根据具体情况进行预试，一般终浓度为3～10
ug /ml），包被体积为100～150ul/well。包被条件37°C 2～6 或4°C过夜。
3） 封闭（blocking）封闭是指用高浓度的蛋白溶液封闭余下的空白位点。其目的是降低本底。封闭缓冲液1-2%BSA。
4） 微孔反应板的鉴定 包被的微孔板应具有良好的均一性和稳定性。均一性用CV值表示，稳定性指酶标反应板的有效期。
5） 固相技术的新进展 被动吸附法包被的抗体利用效率较低，为提高包被抗体的利用率和包被板的质量，固相技术取得一定进展。
蛋白A抗体间接吸附法
链霉亲和素－生物素化抗原或抗体间接吸附法 链霉亲和素属于碱性糖蛋白物质，易于与聚苯乙烯塑料微孔板结合。
戊二醛固相吸附法 适合于多肽、糖脂或聚核苷酸等小分子固相化。
2．抗原和抗体最佳工作浓度的确定
抗原抗体反应要求在最适比例条件下进行，ELISA反应试剂多，其工作浓度不同对结果影响较大，因此必须对包被抗原(抗体)和酶标抗体(抗原)进行最佳工作浓度的滴定和选择，以达到最佳的测定条件。
1）方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原的工作浓度 用包被液将抗原作一系列稀释(1:50～l:800)后，按行进行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液1:100稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照)，保温，洗涤。加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，加酸终止反应后读取A值。选择强阳性参考血清A值；为0．8左右，阴性参考血清A值<0．1的包被抗原稀释度为工作浓度。
方阵(棋盘)法选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度 将抗体用包被液稀释为10mg／L、lmg／L、0.1mg／L三个浓度按行包被，每一个浓度包被三行(每行3孔)，分别在每个浓度包被的第一、二、三行中分别加入强阳性抗原，弱阳性抗原和阴性对照，将酶标抗抗体用稀释液稀释为1:l
000、l:5000、l:10000三个浓度，分别加入每个浓度包被的第一、二、三列中。加底物显色，加酸终止反应，分别读取A值。以强阳性抗原液A值在0.8左右，阴性参考A值<0.1的条件为最适条件。据此选择包被抗体和酶标抗体的最佳工作浓度。
3．操作标准化 操作过程中应注意试剂的配制、加样、反应温度、洗涤、比色等几个方面。
|
|
|
|
