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均相酶免疫测定是将半抗原或小分子抗原如药物、激素、毒品、兴奋剂等与酶结合制成酶标记物，酶与抗原(半抗原)结合后仍保留酶和抗原(半抗原)的活性。测定时将待测样品、酶标记物、特异性抗体和底物溶液加在一起，待抗原—抗体和酶底物反应平衡后，即可直接测定结果，无需分离步骤，整个检测过程都在均匀的液相内进行。依据实验原理可分为竞争结合法和非竞争结合法两种类型。
1．酶扩大免疫测定技术
酶扩大免疫测定技术(enzyme multiplied immunoassay technique，EMIT)，由美国SYVA公司最先研制成功，主要用于小分子抗原或半抗原的测定，在药物测定中应用最多。
原理：半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的生物活性，当酶标半抗原与抗体结合后，半抗原分子上的酶蛋白与抗体密切接触，使酶的活性中心受到影响，酶的活性受到抑制。测定时标本中的半抗原、酶标半抗原与抗体竞争性结合，标本中的半抗原含量越高，加底物后其OD值越高。
如将毒品(如吗啡及其衍生物)与溶菌酶结合成酶标记物，测定时将待测样品、酶标记物与抗体一起混合，让前二者与其相应抗体竞争结合后，加酶底物(藤黄微球菌)，测定反应体系酶的活性；若酶标抗原与抗体结合后，抗体与标记的酶紧密接触，使酶的活性中心受到影响，而其酶活性受抑制(图12—5A)；若待测样品中抗原与抗体结合，酶的活性得以发挥(图12—5B)，酶的活性与待测样品中抗原的量成正比，测定酶活性以标准曲线推算出待测抗原的量。
2．克隆酶供体免疫测定技术
利用DNA重组技术制备β-半乳糖苷酶的两个片段，大片段为酶受体（enzyme acceptor EA），小片段为酶供体（enzyme
donor ED），单独的两个片段均无活性，在一定条件下结合后可显示酶的活性。
抗原（待测）+ 抗体 + 抗原-ED = 抗原（待测）-抗体 + 抗体-抗原-ED
抗体-抗原-ED 具有酶的活性，加底物显色。
一类是抗体能增强酶的活性，将甲状腺素(T-)与苹果酸脱氢酶(MDH)共价结合成酶标记物后，MDH活性被抑制；当标记抗原与特异性抗体结合时，被抑制的酶的活性可逆性地恢复；如样品中T4含量增多，竞争结合抗体，MDH活性仍被抑制；酶的活性与待测样品中抗原的量成反比图12—5Eh41T原理示意图
上述酶标抗原与抗体结合后，酶的活性增强与减弱是由于抗原与抗体的结合位置邻近酶的活性中心。也有用直接与酶活性中心反应的辅助因子或底物等小分子化合物标记抗原，若标记抗原与抗体结合将会干扰这些小分子化合物与酶的结合，从而使酶的活性受抑制。如辅基标记免疫分析法、克隆酶供体免疫分析法、底物标记荧光免疫分析法等。
均相酶免疫测定操作简便、快速、适合于自动化，应用广泛，不仅可检测药物、激素、毒品、兴奋剂等半抗原或小分子抗原，也可测定大分子蛋白质、病毒及细胞性抗原成分。
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