| 1． 生物素的活化
生物素预先活化后，通过噻吩环的戊酸侧链上羧基与抗体、酶等生物大分子以酰胺键偶联。活化生物素的制备是获得高敏感度BAS制剂的关键环节。常用方法有以下几种：
1） 生物素N—羟基丁二酰亚胺酯（biotinyl-N-hydroxy-succinnimide，BNHS）的制备：
取生物素1g混悬于12 ml，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，加人0．6g N-羟基丁二酰亚胺(HOSU)和0. 8
g二环己基碳二亚胺(DCC)，置于密闭容器内，室温下磁力搅拌作用过夜。过滤，滤液经旋转蒸干。加10mL乙醚洗涤，继加200
ml异丙醇使其重结晶，获得白色粉末状晶体。
BNHS酯键中的-C=0基团可与蛋白质分子中赖氨酸的氨基结合，使生物素标记在蛋白分子上，含赖氨酸残基越多，或蛋白质的等电点在pI
6.0以上，其标记效果越好。因此，BNHS适用于标记抗体及中性和偏碱性的抗原。
2）长臂活化生物素(N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoate，BCNHS)的制备
生物素的分子量仅为244.31，当与抗体或酶结合后应用于免疫试验时，极易受到大分子蛋白空间位阻效应(steric hindrance)的影响。使用长臂生物素可以减少位阻效应，提高试验的灵敏度。长臂生物素是在生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加2分子6－氨基己糖，犹如给生物素分子增添一只手臂，使其不受位阻效应影响，更易与抗体、酶等生物大分子结合而发挥作用、BCNHS的制备过程分为两步：先制成长臂生物素，然后再使其活化。
长臂生物素的制备：称取BNHS 3 41 mg ,6-氨基己糖盐酸盐200mg，溶解于5mLDMF，再加入0.152
mL三乙胺(TEA)，室温搅拌下作用20h。蒸发去除DMF，加l mmol/L NaOH 3mL，继加甲醇至溶液变清，搅拌2h。蒸发去甲醇，加10mL蒸馏水，搅拌下滴加浓盐酸酸化至刚果红指示剂恰好变色。室温静置2h后，移放冰箱过夜。收集白色固体物，干燥后用水重结晶，再经真空干燥，所得物即为长臂生物素，平均获得率为64％。熔点为206-215℃。
长臂生物素的活化：称取长臂生物素357mg溶于DMF10ml 。中，加HOSU 130 mg和适量缩合剂，室温搅拌下作用48h。过滤，收集滤液蒸发干，加乙醚洗涤后，用无水异丙醇10－15ml重结晶。所得粉末状固体即为活化长臂生物素，平均获得率为41％，熔点为156-162℃。
3) 生物素酰肼(biotin hydrazide，BHZ)的制备
BHZ是水合肼(hydrazine hydrate)与生物素的合成物，因在生物素的羧基侧链上带有肼基，故能标记带醛基的蛋白质。
BHZ制备过程：取10生物素和氯化亚砜0.1 ml，在搅拌下缓慢加入冰冷的无水甲醇1ml中。溶解后放置28℃24h，继经真空干燥；加无水甲醇lml，待溶解后再次真空干燥。残余物溶于0.5mL无水甲醇，并缓慢加入水合肼0.1ml，置28℃24h后用滤纸过滤，沉淀物用乙醚20ml反复淋洗，最后用DMF
l0 ml淋洗，移置37℃温箱内烘干，放4℃保存备用。
BHZ主要用于标记偏酸性的糖蛋白。如在其侧链上添加1分子赖氨酸作为连接臂，可使生物素免受位阻作用，更易与亲合素结合。
4）肼化生物胞素 (biocytin hydazide ，BCHZ)的制备 生物胞素为ε生物素赖氨酸，是生物素通过C=O基与赖氨酸的ε-氨基连接生成的化合物。BCHZ可与蛋白质的醛基和氨基结合，优于只能与醛基结合的BHZ。
BCUZ制备过程：取生物胞素甲酯100mg溶于甲醇2 ml，加入无水肼0.1 ml，25℃反应48h.浓缩至近乎干燥时，在H2SO4干燥装置中减压抽干，直至只测出少量的肼。产物溶于l
ml蒸馏水中，通过聚苯乙烯型色谱固定相Q去肼。BCHZ可在热乙醇中结晶。
2．生物素结合物的制备
经过活化的生物素及其衍生物可以和各种蛋白质(包括抗体、葡萄球菌A蛋白、酶、激素等)、多肽、多糖、核酸及核素、荧光素、胶体金等结合；并可借助交联剂与细胞、琼脂糖珠等偶联。广泛应用于免疫学、细胞生物学和分子生物学的实验研究领域，以及作为亲和分离制剂，用于相应配基的分离与纯化。以下重点介绍生物素化抗体、抗原及酶结合物的制备方法。
1）生物素化抗体制备
(1)BNHS溶液lmg／ml以二甲亚砜(DMSO)制备。
(2)将待偶联的抗体溶液以0．1m01／LpH9．0NaHCO。配成1—2mg／m1。
(3)将BNHS与待偶联抗体(如IgG)按1：8混合，室温搅拌4h。
(4)4℃条件下使上述混合液体以o．05m01儿，pH7．2PBS透析过夜，加等体积甘油
或0．02％NaN：一30℃分装存放。
生物素化抗体应避免反复冻融，按使用需量分装小瓶。一旦启封稀释使用，勿继续冻
存保留。
2）生物素化辣根过氧化物酶(bio—HRP)制备：
(1)取BNHS(MW454)2．?mg溶于4m1DMF。
(2)以0．1m01儿pH8．4的NaHC02配制5mg／m1的HRP，按BNHS：HRP为1：8
混合(应将BNHS溶液缓慢加至HRP溶液)。置22℃反应4h。；
(3)上述混合液于4℃条件下对0．01m01儿pH7．4PBS透析，48h，中间换液8次以
上。
(4)收集透析液加等量甘油混合，或加o．02％NaN，分装，-20℃存放。
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