Sorry, your browser doesn't support Java(tm).
首页 第一章 第二章 第三章 第四章 第五章 第六章 第七章 第八章 第九章 第十章
您的位置是>> 首页 >> 生物素-亲和素系统标记技术>>生物素-亲和素系统的检测方法与原理>>BAB法
 

  BAB(Biotin-Avidin bind)法或BRAB(Bridged avidin biotin technique)法是利用亲合素的多价性,以亲合素作为中心或桥臂分别将生物活性大分子(如反应体系中的待检抗体、DNA与标记的生物素(如生物素化酶)桥联起来的检测技术。
1.类型:以ELISA酶标生物素为例,可分为直接法与间接法。
1)BAB直接法 该法是以抗原与生物素化的特异抗体作用后,再加游离亲合素。由此,抗原抗体复合物通过生物素可与多个亲合素分子结合,而亲合素又可通过剩余的结合价与后来加入的酶标生物素结合,故使大量酶分子积聚于抗原-抗体复合物周围,当加入相应酶底物,就会出现强烈的酶促反应(显色)。(见图-2)由于每个抗体携带的酶分子显著增加,因此BAB法较一般ELISA法的检测敏感度明显增高。

2)BAB间接法 该法以生物素标记二抗,即制备生物素化抗抗体。分4步完成:①原与特异性抗体(一抗)反应;②加生物素化抗抗体;③加入亲合素④加入生物素标记酶。(见图-3)间接法敏感性优于直接法,但其特异性不如直接法高。


2.检测程序 BAB法检测程序(组织切片免疫组化染色为例)
1) 冰冻组织切片或细胞涂片以丙酮固定,吹干,0.0lmo1/L,pH 7.2 PBS洗片3min,石蜡切片置37℃过夜。
2) 阻断内源性过氧化物每:滴加1%H2O2甲醇,作用10~20分钟。
3) 酶消化(石蜡切片):以0.05%胰蛋白酶(Trypsin)或9%胃蛋白酶(pepsin)消化30~120分钟。
4) PBS洗片,30X3min X3。
5) 加入生物素化抗体,37℃作用60min;PBS洗片,30X3min X3。
6) 滴加适当稀释的亲和素,37℃作用30~60min。PBS洗片,30X3min X3。
7) 加生物素酶结合物,37℃作用60min。PBS洗片,30X3min X3。
8) 0.04%3,3’-二氨基联苯胺(DBA)、0.03%H2O2显色5~12min,洗片。
9) 苏木素郴染30秒,盐水酒精分化,常规封片观察。阳性为棕褐色。