| 应用BAS系统进行分离提纯mRNA的Poly
AT tractRmRNA 是promaga公司90年代的专利注册商品，该法是免疫生物学与材料学结合，制备免疫磁珠，作为标记亲合素的载体颗粒。其原理是基于寡聚胸腺嘧啶脱氧核糖核苷[01igo(dT)]与mRNA3’端polyA的碱基互补配对特性，用生物素标记o1igo(dT)，通过它与mRNA3’端的polyA高效杂交形成复合体，然后用标有亲合素的顺磁球珠和磁性分离架捕获，并洗涤生物素o1igo
(dT)／mRNA-亲合素磁珠，最后用无RNase去离子水将mRNA洗脱下来，达到从总RNA分离mRNA 的目的。
Poly AT tractRmRNA分离系统组成包括①生物素标记o1igo(dT)探针(50pmol／μ1)；②20XSSC；⑧亲合素磁性球珠TM；④无水RNase水；⑤供12X75mm试管用磁性分离
架。
少量mRNA分离程序如下：
1．在无RNase的1.5m1Eppendorf管中加入0.1—1mg的总RNA及无RNase水至终体积为50μ1。65℃加热10min。
2．加3μ1生物素标记oligo(dT)和13μ1的20XSSC于上述RNA管中，轻轻混合，使自然冷却至室温(约10min)，此步是oligo(dT)与mRNApotyA退火处理。
3．亲合素顺磁球珠(SA—PMPS)冲洗处理：
1) 将磁珠(SA—PMPS)轻晃使之散开，置磁性分离架，使SA—PMPS在磁性作用下集中于试管一侧，约30s。
2) 小心去除上清（勿离心!!），再以0.3m10.5X SSC漂洗SA—PMPS。在磁性分离架集中磁珠后，再除上清，依此重复漂洗3次。
4．漂洗后的SA—PMPS重悬于0.1m1的0.5XSSC（30min内使用，因SA—PMPS在无蛋白环境不稳定）。
5．将步骤2中的全部01i80(dT)／mRNA退火反应物加至放有漂洗好的SA—PMPS
1．5m1的Eppendorf管轻轻混匀，放置室温10min。 ；
6．磁性捕获SA—PMPS—oligo(dT)—生物素，小心吸取上清(在确定mRNA分离效果前，最好暂不丢弃上清)以0.1XSSC
0.3m1洗磁珠3次，洗时轻晃管底使颗粒全部悬浮，最后一次尽量移去水相。
7．洗脱mRNA以0．1m1无RNase水重悬磁珠，并以分离架捕获集中SA—PMPS，洗脱液存入新eppendorf管（此为收集的含洗脱mRNA的溶液）。重复洗脱合并，总量为
0.25m1。
8．mRNA的沉淀与贮存
1)mRNA若用于cDNA克隆，可加0.1体积的3mo1/L KAc或NH4AC和1.0体积的异丙醇加入洗脱液，过夜沉淀。
2)12000g离心10min，收集RNA沉淀，用1ml冰冷的75％乙醇洗涤并离心，真空干燥。短期贮存，可将真空干燥的mRNA沉淀溶于无RNase去离子水，浓度为0.5—1.0mol/μl，-70℃存放。
Poly AT tractRmRNA分离系统的各成分应于4℃存放，6个月内活性稳定。
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