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免疫细胞的分离与纯化技术>> 淋巴细胞及其亚群的分离 |
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淋巴细胞是复杂的不均一的细胞群体，它包括了许多形态相似而表面标志和功能各异的细胞群和亚群。根据细胞的表面标志和功能等不同，可借助多种方法分离淋巴细胞亚群。
1．E花环沉降分离法
成熟的T细胞表面表达绵羊红细胞 (SRBC) 受体，即E受体。T细胞能与SRBC结合形成E花环，而B细胞则不能。经Ficoll-Hypaque分层液密度梯度离心，E花环形成细胞因密度增大而沉积于管底。用低渗法裂解花环中的SRBC，即可获得纯化的T细胞。悬浮在分层液界面的细胞群富含B细胞。
2．尼龙棉柱分离法
B细胞易黏附于尼龙棉纤维（聚酰胺纤维）表面，而T细胞则不具此能力，借此可将T细胞与B细胞分离。经过处理的尼龙棉均匀充填聚乙烯塑料管，将淋巴细胞悬液加入柱内，孵育。用洗脱液洗脱，流出液内含有T细胞。重复灌洗几次除去管内残留的T细胞，再用洗脱液边洗边挤压塑料管，可得到B细胞。
本法是实验室常用的分离方法之一，操作简便、易行，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响。所获T细胞纯度可达90%，B细胞纯度可达80%。缺点是尼龙棉可能选择性滞留某些T细胞亚群，尼龙棉黏附的细胞（B细胞和巨噬细胞）的回收率低，且可能混杂有未洗尽的T细胞和死亡细胞。
3．亲和板结合分离法
分为直接法和间接法。直接法用特异性抗体包被塑料平皿或培养板，表达特定膜抗原的细胞即与相应抗体结合而被吸附于平皿或培养板表面，悬液中为不表达特定膜抗原的细胞。例如，用兔抗人Ig抗体包被平皿，再将淋巴细胞悬液置于平皿中温育，则B细胞吸附在平皿上，而其他细胞则不能吸附，由此可分离出B细胞。改变缓冲液的离子强度，将B细胞解离。
间接法是用羊抗鼠Ig抗体（第二抗体）包被平皿，将预先与特异性单抗结合的淋巴细胞与之反应后，可吸附于平皿上，从而达到分离的目的。
该方法的优点是可同时进行细胞的阳性分选和阴性分选，且收获量达。但吸附于亲和板上的细胞分离时可能造成轻微损伤；并且，抗原抗体的结合可导致相应细胞被活化。因此，该方法适合阴性分选。
4．免疫磁珠分离法
免疫磁珠分离法的原理是将抗特异细胞表面的抗体致敏到磁珠的上，形成免疫磁珠(immunomagnetic beads，IMB)。待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏磁珠结合的细胞与其他物质分离，达到纯化、分离的目的。该方法可分为直接法和间接法。
通常有两种分离方式：阳性分离和阴性分离。阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以纯化。前者涉及到磁珠与细胞的解离，简单的方法是37℃过夜即可，也可用商品化的分离系统进行抗原与抗体的解离，使解离的细胞既无抗体残留，又不改变其功能和活性。
以免疫磁珠纯化人B细胞为例。
①抗体包被磁珠：将CD19单克隆抗体与聚苯乙烯磁珠混合，室温摇动5h，用甘氨酸溶液终止反应。
②B淋巴细胞的分离：外周血分离的PBMC与CD19单克隆抗体包被的磁珠混合加入试管中，4℃冰箱温育3min，同时轻振。用磁性微粒收集仪分开CD19+细胞和CD19-细胞，PBS缓冲液洗涤，取出紧贴管壁并与磁珠结合的CD19+B淋巴细胞。
③磁珠与B淋巴细胞的分离：加入RPMI 1640培养液，置37℃ 5%CO2温育过夜。用磁性微粒收集仪贴壁分离磁珠，收集悬液中的CD19+
B淋巴细胞。
免疫磁珠分离细胞方法简便、快速、无需特殊设备，且分离细胞的纯度高，产率大，近 年来已被广泛用于：
①人类各细胞的分离，如T、B淋巴细胞、内皮细胞、造血祖细胞、单核巨噬细胞及胰岛细胞、多种肿瘤细胞等。
②肿瘤的早期诊断，如在体液中检测肿瘤细胞等。
③骨髓移植物的预处理，去除残留肿瘤细胞，提高移植成功率。
④某些科研和医疗工作中特殊细胞的分离或清除。
⑤细胞表面分子的检测。
5．微量细胞毒法
利用特异性抗体结合细胞表面抗原后，在补体作用下使被抗体结合的细胞溶解破坏，从而去掉相应细胞到达分离细胞的目的。如欲分离T细胞，可先分离淋巴细胞，将抗CD20的抗体和新鲜兔血清加入细胞悬液中，37℃
温育30分钟。抗CD20的抗体与B细胞结合，在补体作用下被溶解破坏，洗涤细胞悬液即可获得T淋巴细胞。本方法只适合阴性分离法。
6．流式细胞术分离法
用流式细胞术可自动化地对单个细胞进行多参数定量测定分析，从而可分选出用特异性荧光抗体标记的阳性细胞。用流式细胞术分离细胞准确快速，纯度达90%～99%，细胞活性不受影响。缺点是费用昂贵，拟分离的细胞在混合群体中含量过低时，耗时较长才能获得所需数量细胞。
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