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淋巴细胞数量检测>> T细胞数量检测 |
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1．E花环试验
人类T淋巴细胞表面有绵羊红细胞 (SRBC) 受体，称E受体。该受体在体外可与SRBC结合形成以T细胞为中心，四周环绕SRBC的玫瑰花环样结构，即E花环。E花环试验(erythrocyte
rosette test)常用于T 细胞的鉴定和计数。
1）总花环（Et）试验 分离PBMC，配成一定浓度的悬液。配制SRBC悬液。将PBMC与SRBC按一定比例混匀，孵育。低速短时离心后，置4℃2h以上或过夜。用戊二醛固定后染色，凡结合3个以上SRBC的淋巴细胞为E花环形成细胞(E
rosette forming cell，ERFC)，求出ERFC阳性百分率。
2）活性花环（Ea）试验 PBMC和SRBC按一定比例混匀，低速短时离心后，立即计数ERFC，求出Ea-RFC阳性百分率。
方法评价 E花环试验是经典的细胞免疫功能测定方法，简便易行，但影响因素多，重复和稳定性差，不同实验室所的数值相差较大。现逐渐被免疫荧光技术所代替，但考虑到方法简便，又不需要特殊仪器，故还有一定的实用价值。Et花环试验代表T
细胞总数，其正常参考值为64.4±6.7%。Ea花环试验代表T细胞的一个活性亚群，对SRBC的亲和性高，能反映机体的细胞免疫水平，其正常值为23.6±3.5%。Ea花环比Et花环更能密切反映临床情况，常与临床表现一致。
2．应用间接荧光免疫技术检测CD3＋、CD4＋、CD8＋的细胞数。
1）原理：用抗人T细胞和T细胞亚群的McAb与人淋巴细胞反应，再用标记有荧光素的羊（或兔）抗鼠IgG作为第二抗体，与第一抗体（McAb）反应。在荧光显微镜下，结合有荧光素标记抗体的细胞在黑暗背景下发出荧光，凡是呈现特异性荧光的细胞即为阳性细胞，计数阳性细胞，从而确定T细胞及其亚群的百分率。
2）方法：分离PBMC，配成一定浓度，与抗CD3、CD4、CD8的McAb分别混合，孵育，洗涤。加入荧光素标记的抗鼠IgG，孵育，形成抗原-McAb-荧光素标记抗鼠IgG，洗涤，涂片，在荧光显微镜下计数荧光阳性细胞数，然后分别计算出T淋巴细胞及其亚群的百分率。
3）方法评价 间接免疫荧光法是检测T细胞亚群常用的方法之一。缺点是标本不宜长期保存，需要荧光显微镜才能观察结果，结果易受主观因素影响。如有条件，细胞经荧光标记抗体着染后，用流式细胞仪计数，快速而准确，但需要较多的投资，难以普及应用。正常人外周血中T细胞占淋巴细胞总数的60%～80%，CD4+T细胞35%～55%，CD8+T细胞20%～30%，CD4+T细胞/CD8+T细胞比值约为1.5～2.0∶1。
3．APAAP法检测CD3＋、CD4＋、CD8＋的细胞数。
1）原理 使用酶标记抗体与组织切片或细胞涂片反应，通过酶对相应底物的催化显色，检测细胞的特异性表面标志，从而鉴定细胞种类或其亚群，常用碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（alkaline
phosphatase anti-alkaline phosphatase，APAAP）免疫桥联染色法。抗人T细胞和T细胞亚群的McAb(抗CD3、CD4和CD8的McAb)与淋巴细胞反应，再用兔抗鼠IgG起搭桥作用，其中一个Fab段连接抗T细胞McAb，另一个Fab段连接APAAP复合物，再通过复合物中的AP催化底物显色来判断CD分子的存在，从而确定T细胞及其各亚群百分率。
2）技术要点 分离PBMC，配成一定浓度，涂片，固定。加入一定浓度的相应McAb，孵育，洗涤。加入羊抗鼠IgG抗体，孵育，使其与McAb结合，洗涤。加入APAAP，孵育，形成抗原-McAb-羊抗鼠IgG抗体-APAAP复合物，洗涤。加入AP不溶性底物，孵育。用苏木素染色，冲洗后封片，镜检，高倍镜下观察和计数淋巴细胞，凡是细胞膜有明显红染者为阳性细胞，计算相应CD抗原阳性的T细胞百分率。
3）方法评价 该方法由于使用免疫桥联技术，故其敏感性高，结果易于判断，同时又减少了内源性酶的影响，特异性强。标本可长期保存，而且使用一般光学显微镜就能观察结果。
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