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淋巴细胞功能检测>> T细胞功能检测 |
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1．T细胞转化试验
1）原理 T细胞在特异性抗原或非特异性有丝分裂原的刺激下，细胞的代谢和形态发生变化，主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，发生一系列增生反应，如细胞变大、胞浆增多、胞浆出现空泡、核染色质疏松、核仁明显，并转化为淋巴母细胞。体外刺激T细胞增殖反应的刺激物包括植物血凝素
(PHA)、刀豆素A (ConA)和美洲商陆 (PWM) 、白喉类毒素、破伤风类毒素、纯化蛋白衍生物 (PPD) 和白色念珠菌等。
1）形态学检查法
形态学检查法是依据淋巴母细胞转化的形态学特征，借助光学显微镜进行检测。通过淋巴细胞转化率，可以了解机体的细胞免疫状态。
在无菌小瓶内加入肝素抗凝血、细胞培养液和丝裂原，在CO2孵箱中培养72小时，使T细胞母细胞化。低速离心，取沉淀细胞作推片，干燥，固定，用瑞氏-吉姆萨染色。油镜下计数200个淋巴细胞，记录转化和未转化的淋巴细胞数，按下式计算淋巴细胞转化率。
淋巴细胞转化率= 
形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。缺点是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。正常人T细胞转化率为60%～80%，小于50%可视为降低。
2）3H-TdR掺入法
T细胞在有丝分裂原或特异性抗原刺激下，在转化为淋巴母细胞的过程中，DNA合成明显增加，且其转化程度与DNA的合成呈正相关。此时若将放射性同位素3H标记的DNA前体（3H-胸腺嘧啶核苷，3H-TdR）加入到培养液中，即被转化的淋巴细胞摄取而掺入到新合成的DNA中。测定淋巴细胞内掺入的3H-TdR的放射量，就能判断淋巴细胞的转化程度。
配制含PHA和不含PHA的细胞培养液，分装培养管。将分离的PBMC加入培养瓶中。置CO2孵箱中培养，培养过程中加入适量3H-TdR
。将细胞收集在玻璃纤维膜上，烘干，用液体闪烁仪计数每分钟脉冲数 (cpm)，计算刺激指数 (stimulating index，SI)。
SI=PHA刺激管cpm均值/对照管cpm均值
3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，克服了形态学法易受主观因素影响的缺点，可自动操作。但该法有同位素污染并受同位素半衰期的影响，而且需要昂贵的仪器。
3）MTT比色法
四甲基偶氮唑盐(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide，MTT)
在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，被还原成蓝黑色的MTT-甲月替，形成MTT-甲月替的量与细胞增殖程度呈正相关。因此，测定细胞内形成MTT-甲月替量可见解定量分析细胞内的增殖情况。
配制一定浓度的MTT溶液，过滤除菌和杂质。将淋巴细胞和有丝分裂原共同培养，加入MTT，混匀后继续培养。加酸化异丙醇溶解底物，置分光光度计测定A570nm的值。以刺激指数
(SI) 判断淋巴细胞转化程度。
SI=试验孔A570n均值/对照孔A570n均值
本方法的敏感性与3H-TdR掺入法大致相同，且经济、简便，无放射性污染。
2．T细胞介导的细胞毒试验
1）原理 活化的细胞毒性T细胞(CTL)可杀伤相应的靶细胞，可用同位素标记法测定其杀伤活性。
2）技术类型和技术要点
（1）形态学检查法 淋巴细胞与肿瘤细胞混合共育后，以瑞氏染液着色，用显微镜计数残留的肿瘤细胞数，计数淋巴细胞抑制肿瘤细胞生长的抑制率。
抑制率%= 
（2）同位素法 以51Cr释放试验为例。
用51Cr标记靶细胞，将靶细胞和活化的CTL混合反应，通过检测51Cr的释放率可判断CTL的杀伤活性。
选用适当的靶细胞，常用可传代的已建株的人肿瘤细胞如人肝癌、食管癌、胃癌等细胞株，经培养后制成单个核细胞悬液，按一定比例与效应细胞混合温育一定时间，用计数器测定实验组、自然释放组和最大释放组的
CPM。CTL特异性杀伤能力按下属公式计算：
51Cr特异释放率（%）= 
3）方法评价 T细胞介导的细胞毒试验是评价机体细胞免疫水平的一种常用指标，特别是测定肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力，常作为判断预后和观察疗效的指标之一。
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