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吞噬细胞检测术>> 中性粒细胞功能检测 |
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1．趋化功能检测
1）原理 中性粒细胞在趋化因子如微生物的细胞成分及其代谢产物、补体活性片段C5a、C3a、某些细胞因子等作用下产生趋化运动。趋化运动是整个吞噬过程的第一步，对吞噬功能影响很大。
2）技术要点
（1）滤膜法 又称Boyden 小室法。采用特殊的小盒装置，用一片有一定孔径和厚度的微孔滤膜将小盒分为上下两小室。上室加待检的白细胞悬液；下室加细菌菌体或其产物、酵母菌活化的血清等趋化因子。置37℃温育数小时。上室中的白细胞因受下室内趋化因子的吸引，从上室穿过滤膜进入下室。取滤膜，经固定、干燥、染色和透明等步骤，在油镜下检测细胞穿越滤膜的移动距离，从而判断其趋化作用。
（2）琼脂糖平板法 将琼脂糖溶液倾倒在玻片上制成琼脂糖凝胶平板，按图18-4打孔。中央孔加白细胞悬液，两侧孔分别加趋化因子和对照液。37℃温育2～3h后，用2%戊二醛固定，移去琼脂糖凝胶层，对黏附在玻璃板上的白细胞染色，测量白细胞向左侧孔移动距离即趋向移动距离
(A) 和向右侧孔移动的距离即自发移动距离 (B)，计算趋化指数。
趋化指数=A/B
2．吞噬和杀菌功能测定
1）原理 中性粒细胞可吞噬颗粒性物质（如金黄色葡萄球菌），根据吞噬率 (phagocytic rate) 和吞噬指数
(phagocytic index)可判断该细胞的吞噬功能，根据被吞噬的细菌是否着色测定杀菌率。
2）技术要点
（1）显微镜检查法 将白细胞与葡萄球菌或白色念珠菌悬液混合、温育后，涂片用碱性美兰液染色。在油镜下计数吞噬细菌和未吞噬细菌的白细胞数。对有吞噬作用的白细胞，应同时记录所吞噬的细菌数。按下式计算吞噬率和吞噬指数。还可根据被吞噬的细菌是否着色测定杀菌率
(%)。
吞噬百分率（%）= 
吞噬指数= 
杀菌率（%）= 
（2）溶菌法 将白细胞悬液与经新鲜人血清调理过的细菌（大肠杆菌或金黄色葡萄球菌）按一定比例混合后，置37℃。每隔一定时间取定量培养物，稀释后接种固体平板培养基。37℃培养18h后，计数生长菌落数，以了解中性粒细胞的杀菌能力。
杀菌率（%）= 
3.硝基蓝四氮唑还原能力测定
1）原理
中性粒细胞在杀菌过程中，能量消耗剧增，耗氧量也随之增相应增加，磷酸己糖旁路的代谢活性增强，6-磷酸葡萄糖脱氢酶使葡萄糖的中间代谢产物6-磷酸葡萄糖氧化脱氢转变为戊糖。如加入硝基蓝四氮唑
(nitroblue tetrazolium，NBT)，可被吞噬或渗透到中性粒细胞胞浆中，接受所脱的氢，使原来呈淡黄色的NBT还原成点状或块状的蓝黑色甲月替颗粒，沉积于中性粒细胞胞浆中，称NBT阳性细胞。NBT阳性细胞百分率可反映中性粒细胞杀菌功能
2）技术要点
将肝素抗凝血加入等量的NBT应用液，孵育。取1滴推片，染色，计数NBT阳性细胞，计算NBT阳性细胞百分率。
3）方法评价 此法主要用于检测02的产生能力。正常值为40%～50%，一般以阳性细胞数超过10% 判定为NBT试验阳性。
4．化学发光测定法
中性粒细胞在吞噬经调理的葡萄球菌过程中，出现呼吸爆发，产生的活性氧化代谢产物（如O2-、OH-、H2O2等）可激活化学发光剂鲁米诺
(luminol)类物质，并使之产生化学发光 (chemiluminescence)，发光量与中性粒细胞的杀菌能力相关。
化学发光测定法样品用量少、操作简便快速，是氧化爆发检测中最为敏感，并可直接定量的方法。
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